一種嵌合型不依賴于CAR的膀胱癌特異性溶瘤腺病毒構建及其抗膀胱癌作用研究

來源: www.bnzqvc.live 作者:lgg 發布時間:2017-12-19 論文字數:36859字
論文編號: sb2017121815201318650 論文語言:中文 論文類型:碩士畢業論文
本文是博士論文,在本課題中我們把新構建的嵌合型溶瘤腺病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 與順鉑聯合抗膀胱癌細胞 5637、EJ 和 T24,探索這種新病毒和順鉑之間的相互作用以及初步探討其聯合作用機制
第一章 前言
 
1.1 膀胱癌概述
膀胱癌作為一種常見的惡性腫瘤嚴重威脅著人類健康,且近幾十年來隨著人們不良生活方式多樣化的改變、空氣污染的加重、以及越來越多的接觸化學性致癌物質,患膀胱癌的人數在逐年增多[1,2]。Torre 等人對全球人群最新統計出來的數據顯示:膀胱癌在所有癌癥中是第九位最常見的惡性腫瘤,在男性中的發病率已占男性腫瘤發生的第六位,其致死率在所有癌癥死亡原因中排第 13 位[3]。在一些發達國家中膀胱癌的發生發展趨勢也不宜樂觀,據美國癌癥協會數據統計,2015 年時在全部美國人群中有大約 74000 人被診斷為膀胱癌,在這些膀胱癌患者中因腫瘤本身死亡的人數將近 16000 人,在所有死亡病例中男性患者為女性患者的 3 倍,這種患病率和死亡率的差異可能與男性的吸煙習慣、職業特點、生活壓力、及性激素水平等因素有關[4,5]。我國膀胱癌的發病率與西方發達國家稍有不同,2012 年一項關于我國膀胱癌發生發展的數據統計顯示:膀胱癌總發病率為 6.69/10 萬, 在男性中占第八位,在女性中排名第十二位以后,總死亡率為2.53/10 萬[6]。我國膀胱癌目前的發病率總體低于西方國家,但關于我國城市腫瘤發病率報告以及近些年膀胱癌發生發展調研數據均顯示近年來我國膀胱癌發病率有逐年上升趨勢[6,7]。關于膀胱癌發生的病因比較復雜,是多種因素作用下發生的多步驟的過程,如遺傳、免疫、環境等等,因此目前尚無確切的機制來闡述所有膀胱癌病例的發生。膀胱癌按照腫瘤細胞侵襲的不同層次可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(muscleinvasive bladder cancer, MIBC)。其中,非肌層浸潤性膀胱癌的發病率為 70%左右,相對肌層浸潤性膀胱癌來講,非肌層浸潤性膀胱癌的治療、長期生存率以及預后等都較為樂觀,但是在非肌層浸潤性膀胱癌發生發展過程中,約有 15%的非浸潤性腫瘤可發展為肌層浸潤性膀胱癌[8]。膀胱癌的治療方法較為多樣,首先是根據上述方法對膀胱癌進行分型,然后再根據不同的腫瘤類型選擇相應的治療手段。對于局限性的無遠處轉移的膀胱癌,臨床上主要采取的治療方法是根治性切除治療,一般來講對這種腫瘤采取手術治療后預后好、對病人生活質量影響不大;非肌層浸潤性膀胱癌的治療與局限性膀胱癌相比較為麻煩,首先對部分易于手術的腫瘤組織行經尿道膀胱腫瘤切除術(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)以切除,術后尚需要根據病檢結果判斷腫瘤分期和分級輔助一些其他治療手段;肌層浸潤性膀胱癌的治療最為麻煩,手術之前根據病人整體情況行局部或者全身的新輔助化療,行根治性膀胱切除術后一般尚需輔助一些其他治療手段以提高療效。
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1.2 膀胱癌的基因治療
基因治療是針對各種惡性腫瘤治療的最有希望的策略之一,用于調節遺傳狀態的各種基因治療策略已經應用于膀胱癌治療,并且已經在體外和體內試驗中得到了證實。隨著分子生物學及其相關科學的發展,膀胱癌的基因治療也朝著更加多樣化的方向發展。基于組織病理學和分子生物學的研究已經證實基因的改變與膀胱癌的發展和進展密切相關,且這些遺傳的改變在膀胱癌發病機理中的作用以及與膀胱癌臨床特征的關系逐漸被證明。從膀胱癌的發病機制來講,這些遺傳改變主要包括兩種基因:一種是激活加速癌癥生長的基因:致癌基因(ras, fos, myc, erbB-2,CCND1),生長因子(EGF, EGFR),血管生成因子(VEGF, bFGF),抗細胞凋亡因子(bcl-2, survivin),細胞周期刺激因子(Cox-2)等;另一種是失活抑制細胞增殖的基因:腫瘤抑制基因(p53, p21, PTEN,ARF, CDKN2A),細胞周期抑制劑(p16, TRAIL, Rb),凋亡基因(bax, Fas, gelsolin, TNF),細胞黏附分子(ICAM-1,CCAM-1, CAR)等[11,12]。致癌基因 ras 最初被認定為膀胱癌發生的轉化基因,突變的 ras 致癌基因激活下游蛋白的表達并導致調節基因的轉錄因子發生不受控制的磷酸化。一旦 Ras蛋白被激活,它將失去恢復其無活性形式的能力,并繼續刺激膀胱上皮細胞發生無限增殖[13,14]。致癌基因 fos 也稱為轉錄因子,是一種刺激細胞外有絲分裂的早期反應基因。fos 蛋白與 jun 形成的復合物可以在活化蛋白位點上調節多種基因的轉錄激活,且在信號轉導和刺激膀胱上皮細胞分化中起了關鍵作用[15]。血管生成的過程與膀胱癌的發病機制密切相關,膀胱癌的發生過程中生成的血管的性質與腫瘤的侵襲性和轉移性有千絲萬縷的聯系。環氧合酶-2(Cox-2)是一種前列腺素催化酶,與上皮癌發生中各環節的啟動和癌癥的進展有關系。有研究表明在膀胱癌中 Cox-2 的表達明顯增加,且與膀胱癌的進展相關[16,17]。各種腫瘤抑制基因的異常表達也與膀胱癌的發生和疾病的進展相關。據報道 p53 功能的改變在膀胱癌的多步進展中均起到重要作用,而 50%的膀胱癌患者可發生 p53 基因表達的改變,p53 的失活不僅可以通過遺傳改變導致膀胱癌的發生,還可以通過結合細胞因子如 mdm2 或 by 等改變蛋白質的亞細胞定位[18]。總之,各種不同的致癌基因或者抑癌基因分別在膀胱癌的發生發展中起著重要的作用。
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第二章 嵌合型不依賴于 CAR 的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 的構建、純化及鑒定
 
我們課題組運用分子生物學技術通過制作多克隆位點接頭及限制性內切酶法構建了以 PSCAE 為增強子、UPⅡ為啟動子及 E1A 目的基因的穿梭質粒Rp-PSCAE-UPⅡ-E1A,見圖 2-1。在前期的工作中我們應用該穿梭質粒與傳統 5型腺病毒 Ad5 骨架質粒同源重組形成重組質粒,然后通過 pAdEasy-1 系統構建出了具有膀胱癌組織特異性的溶瘤腺病毒 Ad5-PSCAE-UPⅡ-E1A。我們課題組具有構建膀胱癌組織特異性溶瘤腺病毒的平臺,并熟練掌握病毒構建的相關技術。本課題中利用包含 11p 型腺病毒纖毛的軸區及旋鈕區和 5 型纖毛尾區的骨架質粒 Ad5/F11(p見圖 2-2)與穿梭質粒 Rp-PSCAE-UPII-E1A 在大腸桿菌 BJ5183中同源重組產生嵌合型重組腺病毒質粒 pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A。根據pAdEasy-1 系統,在 HEK293 細胞中包裝重組質粒,構建出不依賴于 CAR 的膀胱癌細胞特異結合的嵌合型溶瘤腺病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A。將得到的重組腺病毒在 HEK293 中擴增,收集后進行純化。在嵌合型病毒的構建過程中分別用限制性內切酶法和普通 PCR 法對嵌合型病毒質粒和病毒基因中 E1A、UPⅡ及 PSCAE 這三種基因進行檢測,驗證嵌合型不依賴于 CAR 的腺病毒構建的成功。下一步用經典 TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose,50% 組織培養感染病毒的劑量)法測定我們收集的嵌合型腺病毒的滴度。腺病毒的成功構建為后續研究該種不依賴于 CAR 的新型嵌合型膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用提供理論基礎。
 
2.1 實驗材料
 
2.1.1 質粒、細菌菌株和細胞株
(1)本課題中所用的腺病毒骨架質粒 Ad5/F11p 由北京軍事醫學科學院王立生教授饋贈;實驗用到的穿梭質粒 Rp-PSCAE-UPII-E1A 和傳統的 5 型溶瘤腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A 為本課題組前期構建并保存于蘭大二院泌研所。(2)實驗中用到的兩種大腸桿菌 BJ5183 和 DH-5α 為本實驗室購買并保存。(3)人胚腎 HEK293 細胞為本實驗室購于美國典型培養物儲藏中心(AmericanType Culture Collection),保存于本實驗室。
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2.2 實驗方法
(1)腺病毒構建的研究中主要使用的細胞株是 HEK293 細胞,HEK293 細胞培養需高糖 DMEM 培養基。(2)從細胞保存液氮罐中取出病毒包裝時需用的 HEK293 細胞,把整個凍存管置于 37~40℃水浴環境中進行復蘇,不停的輕微晃動凍存管盡量在 1min 內使凍存管內的液體完全溶解。然后用新潔兒滅盡可能完全的擦拭凍存管外部后在無菌超凈臺內用加樣槍輕輕吹打凍存管內液體并轉移至 15ml 離心管內,800rpm 離心 5min,棄掉上清,再離心管內加入 5ml 細胞培養液重懸沉淀,重懸時可輕輕吹打以避免出現大量的細胞團塊,然后轉至 25cm2細胞培養瓶,把培養瓶放入含有 5% CO2濃度的溫箱中培養。(3)輕輕的取出細胞培養瓶肉眼觀察瓶內細胞培養液顏色及清亮度,以初步判斷瓶內液體是否有細菌或者真菌污染,然后在顯微鏡下觀察 HEK293 細胞的生長情況、形態、瓶內污染情況等。HEK293 細胞屬于貼壁生長細胞,但是該細胞貼壁不牢靠容易漂浮,因而在對該細胞進行任何操作時均需輕拿輕放,切忌大幅度晃動培養瓶。(4)細胞的換液和傳代均在無菌操作臺內進行。操作之前把需要的 PBS 溶液、0.25%胰酶和培養基從冰箱取出室溫放置一段時間,避免冰箱中取出的試劑直接進行細胞培養。換液時首先倒掉原有細胞培養液,加入 2 ml PBS 緩沖液洗滌培養瓶內殘留的培養液,然后再補充新的細胞培養液約 6ml 繼續置于 CO2細胞培養箱中培養。
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第三章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A對膀胱癌細胞的體外抗腫瘤作用研究 ...... 38
3.1 實驗材料 ........... 38
3.2 實驗方法 ........... 42
3.3 實驗結果 ........... 49
3.4 討論 ..... 623.5 結論 ..... 65
第四章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯合順鉑對膀胱癌細胞的體外抗腫瘤作用研究 ........ 66
4.1 實驗材料 ........... 66
4.2 實驗方法 ........... 68
4.3 實驗結果 ........... 70
4.3.1 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯合順鉑對膀胱癌細胞抗增殖作用...........70
4.3.2 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯合順鉑對膀胱癌細胞凋亡的影響...........73
4.3.3 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯合順鉑對膀胱癌細胞凋亡相關分子的影響.....74
4.4 討論 ..... 76
4.5 結論 ..... 79
 
第四章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 聯合順鉑對膀胱癌細胞的體外抗腫瘤作用研究
 
順鉑(cisplatin,DDP)是一種金屬鉑類無機化合物,在臨床上常作為細胞周期非特異性抗腫瘤藥物而被應用于輔助或新輔助化療[78]。順鉑在膀胱癌的藥物治療應用也較廣泛,無論是常規輔助化療還是新輔助化療順鉑都是一個相對安全、有效和經濟的藥物。順鉑的作用特點是通過藥物理化性質作用于腫瘤細胞的遺傳物質使其無限復制增殖的 DNA 破壞掉,進而影響轉錄翻譯等各個步驟[79]。盡管順鉑在膀胱癌的藥物治療中應用廣泛,但是順鉑的應用也存在較為嚴重的不良反應和耐藥性。溶瘤腺病毒和順鉑這兩者治療膀胱癌的作用機制不同,把兩者聯合起來不僅可以減少各自產生的不良反應,還可以起到協同作用以更大程度的發揮抗腫瘤作用。因而在本課題中我們把新構建的嵌合型溶瘤腺病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 與順鉑聯合抗膀胱癌細胞5637、EJ 和 T24,探索這種新病毒和順鉑之間的相互作用以及初步探討其聯合作用機制。分別取對數生長期的人正常尿路上皮細胞株 SV-HUC-1 和人膀胱癌細胞株5637、EJ 及 T24 制備單細胞懸液以 5000 個細胞/孔的密度接種于 96 孔板中,每孔 100 μL,置于 CO2恒溫培養箱中培養 24 h。實驗用細胞分為四組:不加順鉑和病毒的陰性對照組、單用順鉑組、單用病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 組以及 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 和順鉑聯合組,每組設置 6 個復孔。
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結論
 
(1)Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 聯合順鉑對人正常尿路上皮細胞株 SV-HUC-1無殺傷作用,對 5637、EJ 及 T24 三種膀胱癌細胞有協同抗腫瘤作用。
(2)Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 聯合順鉑可以誘導膀胱癌細胞發生早期凋亡,上調 Fas、Bax 和 cleaved Caspase 3 基因的表達,下調 Bcl-2 基因的表達。
(3)Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 聯合順鉑協同抗膀胱癌的作用機制可能是通過增強內源性和外源性凋亡途徑誘導膀胱癌細胞發生凋亡。
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參考文獻(略)
 

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